Özet

Kanser,   vücuttaki   herhangi   bir   parçasındaki   hücrenin   kontrolsüz   büyümesidir. Kanser/tümör için bir tedavinin saptanması yüzyıldan fazla oldu ve hâlâ tam olarak kanseri anlamak ve tedavi etmek için yetersiziz. Güncel radyasyon, kemoterapi, ameliyat vb. gibi Terapötik teknikler kanser hücrelerinin kökünü kurutmada başarısız olmakta ve uzun ya da kısa vadede nüks etmesine yol açmakta. Bunun sebebi tümörün içindeki kanser kök hücresi(CSCs) olarak bilinen küçük alt popülasyon hücreleridir. Bu hücreler tümörün büyümesi ve gelişmesi için farklılaşmış hücreleri tedarik etmede önemli bir rol oynar.(?)Bununla birlikte, tümörün büyümesi ve metastazı için hücrelerin gelecekteki ihtiyaçları için dokunulmamış popülasyonlarına bakım yapar.(?). CSC’lerin çeşitli tümör tiplerinde mevcudiyetini kanıtlayan birkaç araştırmaya rağmen, her zaman onun varlığı ve bizim CSC’leri histotipe özgü işaretçilerle karakterize ettiğimiz yol hakkında bir soru vardır. Hücrelerin olup olmadığını anlamak için bu bölgeki araştırmaların derlenmesine ciddi bir ihtiyaç vardır, CSC’ler olarak onaylananlar gerçek CSC’ler mi yoksa değilller mi? Bu bölümde, farklı tip kanser için en son CSC kimlik saptama işaretçilerinı bununla birlikte çeşitli izalasyon ve karakterize etme tekniklerini sağlıyoruz, ayrıca bu bölümde CSC’lerin izolasyonu ve karakterize edilmesine dair argümanları ve sınırlamaları vurguluyoruz.

Anahtar kelimler

Kanser kök hücreler, histotipe özgü işaretçiler , metastaz

15.1:Kanser Kök Hücre: Kısa Tarihi ve Güncel Durum

Hepsi bir soru ile başladı, ” Tümöre neden olması için kaç hücre gerekli? “. 1937 yılında,

J. Furth ve onun grubu bir dönüşmüş hücrenin transferi ile fare lösemisinin bulaşmasını rapoladı. Lösemik hücre süspansiyonu lösemik tümörün izolasyonu ve daha büyük partiküllerin çıkarılması için filtrelenmesi ile elde edildi ve bu tek hücre süspansiyonu ile sonuçlanır. Hücre süspansiyonu seyreltilir ve farelere tek bir hücre enjekte edilir ve tümörün oluşum yetenekleri için kontrol edilir. 97 fareden beşi kanser geliştirdi. Sonunda, lösemi tek dönüşmüşhücre ile yetişkin bir birye bulaşabileceğinin sonucuna vardılar (1). 5 yıl sonra 1994 ve 1997 de Jhon E. Dick ve meslektaşlarının bir yayını fare akut miyelengenöz lösemi (AML) deki yalnızca birkaç nadir hücre(farklılaşmamış) transplanatsyonda diğer farelerde lösemi başlatmada yetenekli olduğunu ispatlamıştır. Bu nadir grup hücreler (CD34+ CD38-) farklı soyhücreler üretebilir ve ayrıca kendilerinin farklılaşmamış formlarını daha uzun süre sürdürebilirler. (2,3)

Hâlen, biz onlara, çoğunlukla insan vücudunda bulunan ve kan hücrelerini, bağışıklık hücrelerini vb. Mrydana getiren hematopoietik kök hücrelere benzeyen kanser kök hücreleri diyoruz. Kanser kök hücreler “Kanser-başlatıcı hücreler” , “Kanser kök-benzeri hücreler” ve “Tümör-başlatıcı hücreler” gibi farklı isimlerle adlandırılır ancak hepsi aynı anlamdadır ve kök hücrenin temel özelliklerini taşır. Bunlar tümör içinde bulunan çok potansiyellik, kendini yenileyebilme, klonojeniklik ve tedaviye dirençli olma gibi kök hücre özelliklerine sahiptirler. Her ne kadar bu hücrelerin bağımsız olarak orjinal tümör oluşturma yeteneğine sahip oldukları bulunsada, tümörün kanser kök hücrelerine sahip olduğu   kaynağı   veya   mekanizmayı   ortaya   çıkaramıyoruz.   Sadece,   CSC’lerin   doku kökündeki mutasyon(lar) nedeniyle oluştuğunu gösteren ya da dönüştürülmüş kanser hücreleri mutasyon(lar) sonucu kök hücre özelliği kazanarak kanser kök hücre olduğunu gösteren mümkün teoriler var. CSC’lerin bu özellikleriyle biz CSC’leri geleneksel kanser terapileri ile köklerini kurutamayız (Şek.15.1) ki bu yöntemle sadece tümör oluşturucu olmayan hücreleri öldürürüz ve geriye tedaviden sonra bile CSC’ler kalıcaktır. Güncel tedavi  methotları  kemoterapi,  cerrahi,  radyasyon,  immünoterapi  vb.  içerir.  Tedaviden sonra sadece bir CSC kalsa dahî o tekrar tümör büyütebilir aynı yerde tümör nüksü ile sonuçlanır. Eğer CSC’ler tomör oluştucu olmayan hücreler ile birlikte öldürülürse, tümörün tamamen yok olmasıyla sonuçlanabilir. Sonuçta kanser kök hücre hedefleyen tedavi kanseri kökünden yok edebilir ve kanser nüksü olmayacaktır.Asıl zorluk tümördeki heterojen hücre popülasyonunda kanser kök hücrelerinin nasıl seçileceğidir. Onlar sadece toplam tümör hücrelerinin %1 ‘ inden azını kapsar, bu tüm genomik DNA dizisinde yalnızca bir tane nükleotid polimorfizmi bulmak gibidir. Bizim onları hedeflemek için kimlik işaretçilerine ihtiyacımız var. Yaklaşık 40 kanser kök hücre yüzey işaretçisi yayınlandı ve hâlâ çeşitli kanser hücreleri için sayılmakta (4). Bu hücre yüzey  işaretçiler  içinde  BMI,  b-catenin,  OCT3/OCT4,  SMO,  SOX2,  NANOG,  NOTCH,  vb. başka kök hücre geneleri içerir. Bunlar sürdürülmede önemli rol oynar.

Kök hücrenin karekteri; bu genlerin ifadelerinin gerçek zamanlı PCR analizi ile değerlendirilmesi, izole edilmiş CSC’leri karakterize etmek ve köklülüğü sürdürmek için gereken moleküler mekanizmayı anlamak için kullanılabilir. Meme kanseri durumunda, SOX2 Seviyeleri erken kanser nüksünün teşhisi için bir prognostik belirteç olarak kullanılır (5). Renal hücre karsinomda, OCT4 ve NANOG hastalığın kötü prognozunun tahmininde belirteç olarak kullanılabilir (6). Farklı kanser türleri ile ilgili bu bilgiler, onları hedef almak ve tamamen ortadan kaldırmak için dah fazla kullanılabilir.

15.2: İzolasyon ve Karakterizasyon Teknikleri

Kanser kök hücrelerinin tanımlanmasının iki ana yolu var, biri hücre yüzey belirtecine bağımlı diğeri zar belirteci kimliğinden bağımsızdır. Hücre yüzeyinde belirteç-bağımlı teknikler, hücrelerin yüzey belirteçleri ile hücre sınıflandırılmasında kritik bir adım olarak floresanla aktive edilmiş hücre sınıflandırılmasını (FACS) içerir. Öte yandan, FACS ayrıca farklı tümör tiplerindeki kanser kök hücreleri izole etmek için ALDH1 gibi intraselüler

belirteçlerin saptanmasında kullanılır. Diğer tanımlama teknikleri arasında fenotipik tahlil, sitotoksik  ilaç,  akış  deneyi,  yan  popülasyon  deneyi,  küre  oluşum  deneyi,  somatik  kök hücre özellik, darbe-kovalama yaklaşımı vb. Hemen hemen tüm tekniklerin iddia edilen kanser kök hücre popülasyonunu izole etme ve karakterize etmede artı ve eksileri vardır, bu nedenle CSC’lerin etkili izalasyonu için bu tekniklerin kombinasyonu kullanılır.

15.2.1:Hücre Yüzey İşaretçilerine Dayalı İzolasyon

Kendi hücreleri, bağışıklılık hücreleri vb. vücuttaki hücreler gibi kimlik işaretine sahip olduğundan topluca CD olarak adlandırılan ayrım protein kümesinin yardımıyla, benzer şekilde, ayrıca CSC’lerde CD proteinleri ya da EpCAM/ESA vb. diğer yüzey belirteçlerine dayalı olarak tanımlanabilir. Bu modern yüksek giripçıktılı FACS adlı makine ile elde edilebilir; Floresan etiketli antikorlar kullanılarak hücreleri yüzey işaretçilerine göre sınıflandırılır.  CSC  karakterizasyonu  için,  CD133,  CD44,  CD90  vb.  gibi  mazenkimal  ve hematopoietik kök hücreler için özel farklı belirteçler kullanılabilir. Bu belirteçlerin farklı kombinasyonları bize bir varsayılan CSC’lerin çok küçük popülasyonu hakkında bilgi verir. Bu hücre popülasyonu immun yetmezliğe implantasyon yapıldıktan sonra tümör geliştirebilirse kanser kök hücresş olarak tanımlanır (7). Ayrıca, çoklu alt kültürleme için bunu sürekli yapmalıdır. İzole edilmiş hücrelerin tümörü in vivo taklit etme yeteneğini doğrulamak için, bağışıklığı yetersiz canlıya ksenonakli(genellikle fareler) yapılır. Eğer bu tümör oluşmasına neden oluyorsa ve daha fazla transplantasyon sonucu çoğaltır, sonra izole popülasyonunun kanser kök hücreleri olduğu sonucuna varılır.

İzolasyon protokolü üç ana adıma ayrılabilir; hastadan tümör numunesi izole etme, tek hücre süspansiyonu yapma ve son olarak hücre etiketleme ve akış sitometrisi analizi. Solid tümör uygun yöntemlerle hastadan izole edilir ve uygulanabilirliği en üst düzeye çıkarmak için mümkün olan en kısa sürede işlemeye başlamalıdır. Tek bir hücre süspansiyon numunesi hazırlamak için katı dokudan hücre süspansiyonu yapmak için mekanik   veya   enzimatik(gecelik)   yöntemle   işlenebilir.   Amaç,   tüm   hücre-hücre bağlantılarını veya birleşme yerlerini kırmaktır böylece süspansiyonda ayrı yüzen hücreler elde ederiz. Daha iyi sonuçlar elde etmek için, kombinasyonu maksimum verim sağlamak için kimyasal ve mekanik ayrışma yapılır ve figürde hücrelerin canlılığı yöntemin şematizması ile gösterilmiştir (Fig. 15.2).

Ayrıca,  süspansiyon  hücre  süzgecinden  süzülür  ve  homojen  hücre  süspansiyon işleminde kullanılacaktır. Çoklu hücre yıkaması yapılır ve incelenen yüzey belirtecine özgü floresan etiketLi antikor ile etiketlenir. Hücreler sınıflandırılır ve bağışıklık sistemi yetersizliği olan farelere naklederek bir tümör oluşturma kabiliyeti kontrol edilir. FACS ayrıca hücre bankaları/çalışma laboratuvarı hücre hatlarından CSC’lerin izolasyonu için de kullanılabilir  (45,46).  FACS  tarafından  izole  edilen  CD44+  mide  kanseri  kök  hücresi, farklılaşma  ve  kendinin  yenileme  gibi  kök  hücre  özellikleri  gösterir.  Mide  kanserinde, CD44+ hücreleri kemoterapiye ve ayrıca radyasyona bağlı hücre ölümüne direnç gösterir. Ayrıca,  CD44’ün  devrilmesi  SCID  farelerinde  tümörün  azaldığını  gösterdi  ve  azaltılmış sferoid koloni oluşumunu gösterir (28). Çok sayıda hücreyle çalışırkeni manyetik boncuk destekli sıralama akış sitometrisinden daha hızlı olacaktır. Manyetik boncuklarla yaygın olarak kullanılan yöntemler Dynabeads, manyetik aktive hücre sıralama (MACS) vb. Alınan

numuneye  ve  işaretçi  sayısına  göre  CSC’leri,  FACS’leri  veya  manyetikleri  ayırmak  için erişilmesi gerekir boncuk destekli sıralama gerçekleştirilir (45).

15.2.2:Hücre Yüzey İşaretçisinden Bağımsız İzolasyon

15.2.2.1:Yan Popülasyon (SP) Deneyi

Kök hücreler, antimitotik ilaçları dışarı atmak için yüksek bir kapasiteye sahiptir. Bu hücreler bir kök hücre alt kümesine girer ve “Yan Popülasyon” olarak adlandırılır. Yan popülasyon tahlili, CSC’lerin ilacı sistemden hızla uzaklaştırma kabiliyetini, kemorezistans için karakteristikleri olarak kontrol eder. Normalde farklılaşmış hücreler kimyasalı alacak ve işleyecek veya aynı şekilde hedeflenecektir. CSC’ler ABC taşıyıcı protein ailesi üyelerinin yüksek ifadesi ile ilaç direncine ulaşabilir. ATP’ye bağımlı bir taşıyıcıdır veya aynı zamanda bir ilaç akış pompası olarak da adlandırılır ve molekülleri zarlardan geçirmek için kullanıllır (47-49). ABC proteinlerinin, farklılaşmış hücrelere kıyasla CSC’lerin yanı sıra normal kök hücrelere yüksek kemo direnç sağladığı Glioblastoma (50), kolon karsinomu (51), meme kanseri (52) ve diğer kanser türlerinde (53,54) analiz edilmiştir (55-57). Bu deneyde Hoeschst 33342 boyası kullanılır; bu bir nükleik asit boyasıdır  ve  dsDNA’ya  bağlandığında  mavi  floresan  yayar.  Heterojen  popülasyonda, farklılaşmış tümör hücreleri boyayı tutarken, CSC’ler boyayı yüksek akış kapasitesiyle dışarı  akıtır.  Nöroblastom  hücreleri  söz  konusu  olduğunda,  SP  in  vitro  genişlemeyi sürdürme yeteneğine sahiptir ve ayrıca asimetrik bölünme göstererek SP ve SP olmayan(farklılaşmış) hücreler üretir. Yüksek düzeyde ABCG2 ve ABCA3 ekspresyonunun, sitotoksik ilaçları dışarı atarak daha iyi hayatta kalmaya yardımcı olduğu bulundu (58). SP testinin avantajı, CSC’leri izole etmek için hücreye özgü işaretleyiciye gerek olmamasıdır. CSC’lerin popülasyonu sayıca az olduğundan,  onları FACS yardımıyla izole etmeyi bile zorlaştırır (<%2) (59), boya ile daha uzun inkübasyon bir glioma hücre hattında apopitozu arttırır (60).

15.2.2.2:Küre Oluşum Deneyi

Küre oluşum tahlili, hücre sıralama ve yüzey işaretleyici kullanmadan CSC’ler katı tümörden zenginleştirilebilir. katı tümörler, yapışmayan durumda büyütülür. Bu tahlilde, mitojenik büyüme faktörleri sağlanır ve medya, yapışmayan bir ortam sağlamak için serumdan yoksundur. Mitojenik büyüme epidermal büyüme faktörü (EGF), temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF) vb. dahil faktörler, spesifik hücre hattına bağlı olarak sağlanır. Sağlanması sonucunda yapışık olmayan bir ortamda, ilkel hücreler kümelenerek bir küre oluşturacaktır ve farklılaşmış hücreler komşu hücreler ile iletişimi olmadığı için ölürler. Hücre küresi ilk olarak yapışma faktörleri veya ek substrat yokluğunda, yetişkin fare striatum (beynin bazal ganglionlarının bir parçası) oluşturan küre kültüründe bulundu. Sağlanan tüm mitojenik büyüme faktörü ile sadece ilkel hücreler hayatta kaldı ve farklılaşmış hücreler öldü (61). Bu buluş ile yapışkan ortamda sadece kanser kök hücreleri bile büyütülebilir ve heterojen hücre popülasyonlarından izole edilebilir. On yıl

sonra,  insan  beyni  tümöründen  elde  edilen  bir  CD133+  hücresinin,  yapışmayan  bir ortamda bir nörosfer olarak büyüdüğü gösterilmiştir (62). C6 glioma hücre hattı durumunda,  sadece  SP  hücreleri  serumsuz,  büyüme  faktörü  destekli  ve  yapışmayan ortamda bir tümör küresi oluşturarak hayatta kaldı. Ayrıca C6SP hücrelerinin kültürde SP ve SP olmayan hücreleri oluşturabildiğini ve maligniteden sorumlu olduklarını bildirmiştir (63).

15.2.2.3:Darbe Takip Yaklaşımı

CSC’nin    bir    özelliği    yavaş    çoğalmadır,    yani    çevredeki    diğer    hücrelerle karşılaştırıldığında bunlar hareketsiz aşamada olacaklar ve sadece farklılaşmış hücreleri üretmek için gerektiğinde bölünecekler. Yavaşça bölünen hücreler hücre bölünmesi olmadığı için uzun bir süre DNA analoğunu tutacaktır ve bu etiket tutucu hücre veya kök hücre olarak adlandırılır. Etiket hücrede ne kadar çok tutulursa CSC olma şansları o kadar fazladır. İlk olarak, hücreler BrdU(3H-timidin veya 5-0-bromodeoxyuridine) ve daha sonra hücreleri etiket tutma ile kontrol etmek için incelendi. Bölünen hücrenin etiketi, hücre bölünmesi sırasında DNA replikasyonu nedeniyle seyreltiliceğinden, yüksek etiket tutms özelliğine sahip seçilenhücreler CSC’leri doğrulamak için diğer tahlillerle test edilir (64-66). BrdU  yardımıyla  prostat  kanseri  (PCa)  hücreleri  söz  konusu  olduğunda,  darbe-takip analizleriCD44+ hücrelerinin orta seviye etiket tutucu hücrelerle kollokalize olduğunu ortaya  koymaktadır.  Ayrıca,  bu  hücrelerin  CD44  PCa’dan  daha  proliferatif,  tümörijenik, metastatik ve kolonojenik hücreler olduğu sonucuna varıldı (67).

15.2.2.4: Aldehit Dehidrojenaz (ALDH)Aktivitesi

ALDH1 meme, kolon vb. Gibi birçok kanserde CSC’lerin tanımlanması için dahili bir belirteç   olarak   kullanılmıştır.   ALDH,   aldehitlerin   asitlere   piridin   nükleotid   bağımlı oksidasyonunu  katalize  eden  bir  enzimdir.  Örneğin,  retinoid  sinyalleme  durumunda ALDH1,  sitoplazmada  retinolün  retinoik  aside  (RA)  dönüşümünü  katalize  eder  ve  son olarak RA kök hücre ve kanser kök hücrelerin düzenlenmesine yardımcı genleri aktive eder. ALDH substrat spesifik değildir; bu özelliği ile organizmayı potansiyel olarak zararlı ksenobiyotiklerden korur ve kök hücreleri aldehide özgü ksenobiyotiklere karşı dirençli hale getirir (68). Ticari olarak temin edilebilen floresan ALDEFLUOR tahlil kiti, ALDH substratı ve bir ALDH inhibitörü (dietilaminobenzaldehid) yardımıyla ALDH aktivitesini tanımlamak için kullanılabilen bir negatif kontrol. ALDEFLUOR testi ile, göğüs hücre dizisinden CSC izalasyonu yapılır (69) ayrıca akut miyeloid lösemiden ve bu yöntemle multipl   miyelom   CSC’leri   izole   edilir   (70-71).   Ayrıca,   izole   edilmiş   hücreler,   yani ALDELFUOR positif ve negatif hücreler toplanır ve izole edilmiş kanser kök hücrelerini doğrulamak için tümör ksenograft çalışmaları, kök genlerinin ekspresyonu vb. üzerinde çalışılabilir.  Renal  hücreli  karsinomda(RCC),  metastatik  ACHN  hücre  hattında  ALDH1+ hücrelerinin sayısının birincil KRY/Y hücre hattına kıyasla iki katına çıktığı bulunmuştur. Ayrıca,  ALDH+  hücreleri,  ALDH  hücrelerinden  daha  yüksek  küre  oluşturma  yeteneği gösterir (72).

15.2.2.5:Tümorijenite Testi Heterojenliği Yeniden Oluşturma Testi Olarak da Bilinir Yavaş bölünme, kendini yenileme özelliğinin yanı sıra bir kanser hücresi yeni

büyüme bölgesinden yeniden heterojen bir nüfus oluşturabilme özelliğinin olması gerekir; bu özelliğe tümörijenisite denir. Prospektif kanser kök hücreleri olarak izole edilen tüm hücreleri bağışıklığı baskılanmış farelere enjekte edildiğinde aynı hücre heterojenliğini taklit etme yeteneğini kontrol etmek için ayrıca analiz edilir. Bu, ilk kez J. Furth ve diğerleri tarafından bağışıklık yetersizliği olan farelerde lösemi oluşturmak için kaç hücrenin gerekli olduğunu bilmek ispat edildi. Araştırmaşarına göre katı bir tümör izole edilmiş ve tümörü tek hücre süspansiyonuna işledikten ve seyreltmeyi sınırladıktan sonra, hücrelerin spesifik miktarı sayıldı ve NOD-SCID farelerine cilt altından enjekte edildi (1). Bu araştırma tümör rejenerasyonundan sorumlu küçük bir hücre popülasyonu olduğunu ve tümör ksenograft model onları iyi bilmenin daha kolay yolu olduğunu ortaya koydu. Belirtece bağlı CSC izolayonuna en iyi alternatiftİr. Sınırlayıcı seyreltme tahlili, emek yoğun bir süreçtir ve zaman gerektirir ancak sonuçlar oldukça kabul edilebilir. Tümör oluşumunu kontrol etmek için daha az sayıda hücre tanıtıldığından bunların kimliği çok iyi bilinebilir.

15.3: Kanser Kök Hücrelerinde Tartışmalar

CSC’lerin  keşfi,  muazzam  bir  efor  veya  kanser  ve  tümör  nüksünü  tedavi  etme yollarından sonra bile kanser tedavisine veya kanserde hayatta kalma direncinin arkasında bir neden sağlayan harika bir buluştur. Bu ayrıca kanser tedavisi için yeni bir yaklaşım belirlememizi, yani kanser köklerinin tamamen ortadan kaldırılması için CSC’leri hedeflememizi  sağladı.  Ancak  CSC  hipotezi  tartışmalıdır;  çünkü  kanser  kök  hücre tanımlamada farklılık, yalnızca hücre yüzeyi belirteçlerine güvenme ve standart fonksiyonel  tahlillerin  eksikliğidir  (73).  CSC’ler  kanser  kök  hücreler,  tümör  başlatan hücreler veya kanser kök benzeri hücreler gibi birçok farklı terminolojiyle bilinir. CSC’ler ve tümör başlatan hücreler aynı hücre popülasyonu olarak kabul edilmez. Bunun nedeni, tümör başlatan hücre implantasyondan sonra tümör oluşturabileceği anlamına gelirken; CSC’lerin orijinal heterojenliğin yanı sıra tümörü de yeniden iskan edebilmesidir. Hücresel heterojenliği göstermenin yanı sıra tümörijenisiteyi kontrol etmek için ölçümler yapılmalıdır.

15.3.1:Hücre Yüzey İşaretçilerine Güvenme

lTablo 15.1‘de tasvir edildiği gibi, farklı araştırma grubu bulgularına dayalı olarak tek bir kanser türü için birçok CSC belirteci vardır. CD133 belirteci çoklu tümör benzeri glioblastoma (42), yumurtalık kanseri (20), prostat kanseri (8) vb.’de ifade edilir. Bir araştırma  grubu,  CD133’ün  küçük  olmayan  akciğer  kanseri  için  bir  CSC  belirteci olmadığını buldu (74). Diğer grup, CD133’ün NSCLC durumunda cisplatine direnç yoluyla tümör  başlatan  bir  hücrenin  kabiliyetini  gösterdiğini  buldu  (75).  Bunun  haricinde, belirteçlerin kombinasyonu yalnız bireysel belirteçlerden ziyade tümörijenik özellikleri gösterir (75). Tüm bu bulgular, bizim bireysel kanser türü için evrensel bir belirtecimiz olmadığını ve üst hiyerarşide karakteristik küçük hücre dizileri popülasyonu bulmamız gerektiğini gösterir. Farklı araştırma grupları, CSC’leri izole etmek için çeşitli hücre yüzeyi belirteçlerinden istifade ederler. Heterojen tümördeki CSC’lerin bu alt popülasyonları pankreas kanseri durumunda raporlandığı gibi çok daha azdır.

Table 15.1 Çeşitli kanser tiplerinin kanser kök hücre belirteçlerinin listesi

Hücrelerin %0.2-0.8’i tümörojenik olamayan kanser hücrelerine kıyasla artmış tümörojenik potansiyel gösterir (14). Ayrıca glioblastoma(GBM) durumunda, CD133+ varsayılan bir CSC belirtecidir ama son zamanlarda bu diğer gruplar tarafından sorgulanmıştır. CD133+ CSC’lerin kültüründe CD133 hücre popülasyonu tümör oluşturamaz.   Ancak   bireysel   izole   edilmiş   daha   öncede   raporlanmamış   CD133, tümörijenik potansiyel gösterir (76). CD133+ CSC kültürü sadece küçük bir primer glioblastomalar setini sürdürür. Bu CD133+ hücrelerinin ana CSC’lerden erken farklılaşmış hücre olduğu anlamına gelir ve bir heterojen tümör popülasyonu oluşturan farklı nesiller üreten  ilk  hücre  hattını  işaretlememiz  gerekir.  Bundan  yola  çıkarak,  orjinal  tümörü tekrarlayan ve heterojenliğin devamlılığını sağlayan tümör hücrelerin heterojen popülasyonunda  başka  bir  tümör  başlatan  hücre  olabileceğini  varsayabiliriz.  FACS, MACS’in seri seyreltme ve NOD/SCID farelere transplantasyon tekniklerindeilerlediğimiz için belki yakında her kanser türü için evrensel işaretçiler ile CSC’leri izole ve karakterize edebiliriz.

15.3.2 : Tümör Heterojen Popülasyonu Modeli

Tümörü heterojen hücre popülasyonu olarak adlandırdığımız için bu tümörün büyümesi ve gelişmesinde kilit nokta rolündedir. Şu anda, tümörde heterojen popülasyonunu izafeten iki model var, CSC modeli ve stokastik model. Şekil 15.1‘de gösterildiği gibi, CSC modeli, birçok kanserin büyümesinin ve ilerlemesinin CSC’ler adı verilen küçük, yaygın olmayan bir hücre alt popülasyonu tarafından yönlendiğini öne sürer. Normal dokulardaki kanser hücreler olarak çalışarak normal doku gelişimini taklit ederler. Stokastik model, bir kanser hücresinin reaksiyonunun rastgele olduğunu ve ortamdan yani içsel ve/veya dışsal faltörlerden etkilendiğini öngörür (77). İnterlökin 6 (IL6, kök olmayan kanser hücrelerinin(NSCC’ler) CSC’ler oluşturmak için indükleyebilir. CSC’ler NSCC’lerle karşılaştırıldığında daha çok IL6’ya sahip olduğu gösterilmiştir ve bu yüzden artmış IL6 ekspresyonuna sahip kök olmayan kanser hücreleri NSCC hücrelerine CSC hücrelerine dönüşmeleri için talimat verebileceği hipotezi oluşmuştur. Bu meme ve prostat kanser hücre dizilerinde ve ayrıca insan meme tümörlerinde raporlandı (78). Kolon  kanseri  durumunda,  CD133+  hücreleri,  SW620  insan  kolon  hücrelerinden  elde edilen potansiyel kanser kök hücre popülasyonudur (79). İspat edilen yakın tarihli çalışma, kök olmayan kanser hücresinden(NSCC) CSC’nin bölünme tiplerinin in situ immünofloresan  ile  göstermiştir.  Sonuçlar  gösteriyorki,  hatta  kök  olmayan  kanser hücreleri çalışmalarındaki gibi radyasyon gibi dış faktörler nedeniyle CSC’lere farklılaşabilir (80). Tanımladığımız CSC’ler hücrenin plastisitesi ve nişleri nedeniyle belirli bir kanser türü için evrensel CSC’ler olmayabilir. Her ne kadar her iki modelde teorik ve deneysel temellere dayansada ve kanser terapi heterojen popülasyon boyunca CSC’leri hedefler, ana tümörün heterojenliğini sürdürmek ve yeniden oluşturmaktan sorumlu hücreye ilişkin netlik sağlayacak bu iki modelin kombinasyonunun oluşturulması daha iyi olacaktır.

15.3.3: NOD/SCID Fare Sistemindeki Sorun ve CSC’lerin FACS Aracılı İzolasyonu Tümördeki heterojen hücre popülasyonunda CSC’lerin varlığı oldukça nadirdir. Obez

olamayan diabetik/ağır kombine immün yetmezliği olan (NOD/SCID) fareler CSC’lerin tümörijenik yetneklerini doğrulamak için bir in vivo model sistemi olarak kullanılır. Çalışmalar,   insan   kanser   hücrelerindeki   heterojen   hücre   popülasyonunda   yalnızca

%0.1-0.0001’nin çeşitli kanser türlerinde bir tümör başlatabileceğini göstermiştir. NOD/SCID  farelerinin  hepsinin  bağışıklığı  eşit  derecede  baskılanmamıştır,  bu  da  bir araştırma gurubundan diğerine sonuçların değişmesine neden olur. NOD/SCID farelerinin bağışıklığının tehlikeye atılmasına ilişkin kriterler yoktur, tümör oluşumu için hücreler enjekte edilirken bağışıklıklarının ne kadar tehlikeye atıldığı bilinmez. Akut miyeloid lösemi(AML) durumunda, şu şekilde gösterilmiştir: Quintana ve ark. bir ksenotransplantasyon sistemi olarak daha yüksek bağışıklığı baskılanmış NOD/SCID farelerinin kullanılması tümör popülasyonunda tümörojenik hücre yüzdesini arttırır. Çalışmaları,  tümörden  izole  edilmiş  hücreleri  biri  yüksek  bağışıklığı  baskılanmış  diğeri normal farklı iki NOD/SCID farelere enjeksiyonu ve iki deneydeki tümör başlatan hücrelerin yüzdesinin karşılaştırılmasına odaklanır. Bu çalışmaların sonuçları, NOD/SCID farelerinde seyreltme ve tek hücre naklini sınırlayarak tümör başlatan hücrelerin yüzdesinin  sayıca  %25-27  oranında  arttığını  gösterdi  (81-83).  AML’de,  CD34+/CD38 hücrelerinin tümörü tekrar oluşturma yeteneğine sahiğ olduğu gösterilmiştir. Floresanla aktive olan hücre ayırma, hücre yüzeyi işaretçisi için floresanla konjuge antikorları kullanır ve antijenin ekspresyonuna dayalı farklı fraksiyonlar toplandı ve NOD/SCID farelere nakledildi. Bu çalışmada, CD34+/CD38 AML’den izole edildi, antikorların kendisi Fc aracılı nakledilen hücrelerin hayatta kalmasını etkiledi ve bu fareleri immünosupresif antikorlar ile tedavi uygulanarak aşıldı. Bu, lösemi başlatan hücrelerdeki artışı gösteren başka bir örnektir   (84).   bu   bulgu,   üzerinde   CSC   hipotezinin   kurulduğu   aynı   AML   üzerinde gerçekleştirildi ve bu, birden fazla tümör başlatan hücre fenotipine sahip olmasına neden oldu. Bu nedenle, eğer test sistemleri bir laboratuvardan diğerine eşit şekilde bağışıklık baskılamıyorsa, üretilen verilerin hataya açık olabileceği sonucuna varılabilir. Ayrıca, tek hücreleri hücre popülasyonundan izole etmek için kullandığımız antikorlar, sıralanmış hücreler üzerindeki etkileri ve bir tümör üretme yetenekleri açısından da incelenmelidir. Farklı katı tümörlerdeki CSC’lere dayalı tüm çalışmaları sorgular, izole edilen hücrelerin gerçekten CSC olup olmadığını ve izole edilmiş hücrelerin doğrulanmasının yapılması gerekir.

15.4: Sonuç ve Gelecek Perspektifleri

Çok sayıda kanıt ve araştırma, sadece küçük bir ayırt edici hücre popülasyonun birçok farklı kanser türünde tümör ve orijinal heterojenite oluşturma yeteneğine sahip olduğunu kanıtlamaktadır. CSC’leri hücrelerin karışık popülasyonundan izole etmek ve karakterize etmek için birçok yöntem geliştirilmektedir. Farklı kanser türleri vardır ve mevcut araştırmalar  tanımlanan,  doğrulanan,  karakterize  edilen  ve  yayınlanmış  tek  bir  kanser türünde  CSC’lerin  çoklu  kombinasyonlarını  bulmuştur.  Ancak,  bu  verilere  gerçekten güvenebilir miyiz? Tek bir kanser türü için birden fazla CSC tanımlandığından, kanseri kökünden yok etmek için hangi CSC’nin hedeflenmesi gerektiğine nasıl karar verebiliriz? Aradan beş yıldan fazla zaman geçti ama yinede CSC’ler için kesin bir tanım yok ve farklı

araştırmacılar CSC’ler, tümör başlatıcı hücreler vb. gibi farklı isimlerle adlandırıyor ancak standart bir anlam veya tanım yok. CSC ana tümörü yeniden özetleyebilen ve orijinal heterojenliğini  koruyan  hücre  anlamına  gelirken,  tümör  başlatıcı  hücreler  NOD/SCID farelerine nakledildikten sonra bir tümör oluşturabilen hücrelerdir. Son yayınlar, John E. Dickand meslektaşları tarafından gerçekleştirilen ve CSC teorisinin kurulduğu deneye dayanan  CSC’lerin  varlığına  ilişkin  soruları  gündeme  getiriyor.  Araştırmalar,  tümör başlatan hücreleri belirlemeye yönelik standart tahlillerin, hücre popülasyonundan tümör rejenerasyonu için sorumlu hücre tam olarak saptanamadığını gösterir. Ebeveyn tümöründen izole edilen CSC’lerin sağlam bir fonksiyonel analizini gerçekleştirmek için uygun bir deneysel sistem kurulmalıdır. CSC’lerin uygun karakterizasyonu için in vivo ksenograft deneyleri rafine edilmelidir. Sadece CSC’lerin izolasyonu ve tanımlanması önemli  değildir,  aynı  zamanda  CSC’lerin  normal  kök  kanser  hücrelerine  karşı  gen ekspresyonunun anlaşılması da mecburidir. Beklenmeyen içsel veya dışsal faktörler de hücrelerin normal veya kanser kök hücresi olma kaderinde önemli bir rol oynamaktadır. Ayrıca,  kök  olmayan  genler  CSC’lerin  ve  normal  kök  hücrelerin  kök  hücre  özelliğini sürdürmesine yardımcı olanlarla aynıdır. Bunun daha iyi anlaşılması, yalnızca hücre yüzey belirteçlerine güvenmekle kalmayıp, bu genleri aşırı ifade eden hücrelerin hedeflenmesine yardımcı olur. Ayrıca, heterojen popülasyonundan sorumlu hücre hakkında net bir anlayış elde etmek için tümör heterojenitesi için daha iyi bir model tasarlamamız gerekiyor. CSC’leri anlama konusunda uzun bir yol kat etmemize rağmen ancak birçok varsayımın geniş tanım, sınırlı testler ve CSC’leri belirlemek için esas olarak yüzey işaretçilerine vb. dayananan kalite standartları gibi tartışmalara yol açtığı sonucuna vardık. CSC’lerin izolasyonu ve karakterizasyonu için standart bir tanım ve titiz analizler listesinin zorunlu hale getirilmesi ve CSC’lerin izole etmek, analiz etmek ve anlamak için dünyanın dört bir yanındaki  araştırma  grubu  tarafından  takip  edilmesi  gerekir.  Yüzey  belirteçleri,  yan popülasyon  analizi,  sferoid  tahliller  vb.  kullanılarak  tek  başına  analiz  edilmesi,  bu yöntemlerinin her birinin sınırlamaları nedeniyle bir hücre popülasyonunun CSC olması için güçlü bir destekleyici veri sağlamayacaktır ancak bu yöntemlerinbirleştirilmesi birlikte güçlü bir kanıt sağlayabilir. Bu nedenle, CSC’lerin tanımlanması için birleştirici bir yaklaşımı listeleyen bir klavuz kesinlikle gereklidir. Bu, şuanda dünya çapında araştırma grupları tarafından kullanılan farklı yöntemlerin sınırlamalarından kaynaklanan olası tartışmaları daha da azaltacaktır. CSC’leri anlamak için mevcut stratejiler herhangi bir kurala bağlı değildir ve bu küçük hücre alt popülasyonları hakkında daha fazla netlik elde etmek için standart bir uluslararası bir kılavuz oluşturulmalı ve izlenmelidir. şimdi CSC teorisindeki bu kara noktaları temizlemenin ve daha iyi bir gelecek için bu korkunç hastalığı ekarte etmek ve varlığını insan türünden çıkarmak amacıyla araştırmaları yönlendirmenin tam zamanı.

Teşekkür: yazarlar, Ravi Gor’a alt yapı ve burs için SRM Bilim ve Teknoloji Enstitüsü’ne teşekkür eder. Ayrıca Bilim ve Mühendislik Araştırma Kurulu’ndan (EMR/2017/002874) ve Biyoteknoloji Bölümü’nden (BT/PR26189/GET/119/226/2017) bize sağlanann finansman desteğine de teşekkür ederiz.

KAYNAKÇA:Cancer Stem Cells: New Horizons in Cancer Therapies, Editörler: Surajit Pathak Antara Banerjee